壳寡糖脱乙酰度(D.D.)的测定方法

发布时间：2015-12-31 09:25:51

 脱乙酰度(DD)定义为氨基葡萄糖结构单元数与总结构单元数(氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖之和)的摩尔比，是壳寡糖分子中氨基含量的一个指标，它是影响壳寡糖及其衍生物生物活性的重要参数。

 脱乙酰度(DD)的方法主要分为三类：

1、光谱法： 紫外、红外光谱和核磁法；

1.1 红外光谱法

红外光谱(IR)法测定壳寡糖脱乙酰度是利用壳寡糖特殊基团的红外吸收峰测定的；

红外光谱法( IR) 操作简单快速且需样品量少，主要用于结晶样品的定量分析，但IR法与核磁法相比，结果准确性不如核磁法。

1.2 紫外光谱法

紫外光谱法或一阶紫外光谱法利用N-乙酰-D-葡萄糖胺吸光度与浓度呈线性关系，测定壳寡糖DD值，此法在低浓度溶液测得时得到的结果比较准确，紫外法测定壳寡糖DD值，方法操作简便，但样品处理过程中的色素或不溶性杂质会存在干扰测定，会使测定DD值产生大的偏差。

1.3 核磁(NMR)方法

核磁(NMR)方测定壳寡糖脱乙酰度，根据壳寡糖分子中不同氢质子的化学位移值不同，通过测试样品氢质子的积分面积与所选参比氢质子积分面积比较，计算出壳寡糖DD值。

与其它方法相比，NMR重现性好，且准确度高，是目前测定壳寡糖脱乙酰度最准确的方法之一，它的局限性在于需专门的核磁共振仪及专人操作，昂贵的核磁共振仪限制了NMR测定方法大规模地推广应用。

2、破坏样品法：色谱法、元素分析法； 

2.1 元素分析法

元素分析法测定壳寡糖样品中C、H和N杂原子，DD值由C/N比计算获得。

元素分析法的优点是样品无需特定物理状态，准确度较高；缺点是对样品的纯度要求很高，壳寡糖或其衍生物常含有结晶水、吸附水或少量杂质，导致测定结果不准，故样品处理好坏对测定DD值影响很大。

2.2 色谱法

色谱法测定甲壳素或壳寡糖DD值多采用液相色谱法( HPLC)和气相色谱法(GC)色谱法概括为两步：其一是分解样品，如酶解壳聚糖或壳寡糖得到β-D-葡萄糖胺和β-D-乙酰-葡萄糖胺，酸水解得到乙腈乙酸或乙酰胺产物；其二是选择合适的色谱法测定其降解后的特征产物。

色谱法不仅可用于壳寡糖样品DD值测定，而且对不溶的甲壳素和壳聚糖也适用。

3、滴定法： 酸碱、电位和胶体滴定等方法。

3.1 酸碱滴定法

利用壳寡糖的自由氨基呈碱性，可与酸定量的发生质子化反应，形成壳寡糖的胶体溶液，过量的氢离子用碱返滴定，由碱消耗量，计算壳寡糖中氨基含量而获得 DD 值。

酸碱滴定法不需特殊仪器，适合生产过程的粗略测定壳寡糖 DD 值得测定；但酸碱滴定法滴定过程较费时，测试结果易受溶液的温度离子强度和pH等影响，较难准确获得壳寡糖DD值。

3.2 电位滴定法

电位滴定法测定壳寡糖DD值，原理与酸碱滴定法相同，依据电位滴定曲线变化判断滴定终点，滴定曲线是一条S型曲线。

电位滴定法测定壳寡糖DD值，近滴定终点时，析出的壳寡糖分子覆盖电极膜，使准确判定壳寡糖溶液的pH变得困难，影响到壳寡糖DD值测定。

3.3 胶体滴定法

胶体滴定法是测定水溶液中聚电解质带电基团的分析方法，其原理是聚阴离子与聚阳离子间迅速的化学计量反应。

胶体滴定法比较稳定，重现性好，但溶液 pH 值、浓度、滴定速度和离子强度等因素对该法测定 DD 值有影响。